基因编辑猪用于器官移植取得新突破，联想之星被投企业启函生物进展获《科学》杂志报道【星医疗】

2017年11月，合成生物学家杨璐菡博士与美国科学院和工程院双院院士、哈佛大学George Church教授共同创立杭州启函生物，致力于使用世界先进的基因编辑技术生产出可用于人体移植的安全有效的细胞、组织和器官，解决中国和世界器官移植供体严重短缺的问题。目前，人类器官移植供体是严重未满足的医疗需求。由于相似的器官大小和生理特性，长期以来人们一直认为猪是人类移植细胞、组织和器官的希望来源，并进行了许多尝试，但实现理想的异种器官移植还有一段距离。

2019年12月19日，杨璐菡团队在预印版bioRxiv 在线发表题为“Extensive Mammalian Germline Genome Engineering”的研究论文。该研究使用CRISPR-Cas9和转座子在42个等位基因上对猪基因组进行了工程改造，并生产了带有PERV灭活，异种抗原KO和9种有效人类转基因的PERVKO.3KO.9TG猪。体外试验表明，这些猪对人的体液和细胞介导的损伤以及凝血功能异常具有明显的抵抗力，与同种异体移植相似。成功创建PERVKO.3KO.9TG猪表明向安全有效的猪异种移植迈出了重要一步，也代表着在生物体内工程新功能的合成生物学成就。

同日，《科学》（《Science》）杂志发表了题为“Eyeing organs for human transplants, companies unveil the most extensively gene-edited pigs yet”的文章，报道了杭州启函生物以基因编辑技术改造猪，以期望将基因编辑猪的器官用于人体器官移植的研究工作。

文章指出，该研究推出了迄今为止基因编辑最广泛的猪，是目前在全球范围内最接近于将猪作为人体器官移植的供体，为异种器官移植奠定了基础。启函生物和其在美国麻州剑桥的合作方eGenesis（由杨璐函和George Church共同创建），已经开始试验将猪器官移植到非人灵长类动物，该试验是将这一工作推进到人体临床试验的关键步骤。在这次最新研究中，杨璐函团队第一次将敲除PERV和免疫排斥（13个基因）改造同时进行，培育出健康且器官功能完整的猪，初步细胞实验表明人体对这些猪的细胞的免疫排斥反应降低了90%。但最重要的试验仍在进行中，即将这些器官移植给狒狒和猴子，以检验其安全性和存活时间。杨璐函表示，团队在2020年仍将聚焦临床前试验，期望在5年内能开始试验将猪器官移植给人体。

注：图片为两个5天大的PERVKO·3KO·9TG仔猪的图像

多年来，业界一直在寻求异种移植的突破，特别是使用猪器官进行人类移植，作为器官衰竭患者的替代选择。但是，该方法的临床应用面临两个主要障碍：一是猪内源性逆转录病毒（PERV）跨物种传播的风险；二是猪移植物和人类受体之间的分子不相容性。

PERV可以在体外感染人细胞，在细胞之间繁殖，并重组以适应人宿主，这可能引起人畜共患病。PERV整合到人类基因组中可能会导致免疫缺陷和肿瘤发生。由于PERV序列是猪基因组的一部分，因此无法像其他人畜共患病原体一样通过生物安全育种消除。目前已经证明，通过使用CRISPR靶向重复元件（以下简称“ PERVKO”）可成功生产不含PERV的猪，将PERV元件的全部25个拷贝的全基因组灭活，消除了病毒传播的潜在风险。George Church、杨璐函及其合作者们，于2017年培育出了健康的完全去除PERV基因的猪。

而临床异种移植的另一个障碍是由于猪器官和人类免疫系统之间的分子不相容性导致的器官排斥。特别是某些聚糖表位，主要是α-Gal（半乳糖-α-1,3-半乳糖），Neu5Gc（N-糖基神经氨酸）和SDa表位，是猪所特有的，预先形成的抗体的结合可通过补体级联的激活方式引发超急性移植排斥。GGTA1（α-1,3-半乳糖基转移酶），CMAH（胞苷单磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶）和B4GALNT2（β-1,4-N-乙酰-半乳糖胺基转移酶2）的遗传失活可去除α-Gal，Neu5Gc和 SDa表位，已显示可减弱这种快速的移植排斥反应。

此外，人类补体调节蛋白的过表达，包括CD46（膜辅因子蛋白），CD55（衰变促进因子）和CD59（MAC抑制蛋白），可进一步减少超急性排斥反应并延长移植物存活时间。除了体液损伤和超急性反应外，对异种移植物的急性细胞反应，包括自然杀伤（NK）细胞和巨噬细胞的浸润，都有助于异种移植排斥。已经证明人B2M-HLA-E融合蛋白在猪内皮细胞中的表达通过抑制性信号传导降低了NK介导的细胞毒性，而人CD47的表达通过CD47与SIRPα的相互作用降低了巨噬细胞介导的毒性。

同时，猪与人凝血系统之间的不相容性也可能导致血栓性微血管病和全身性消耗性凝血病，这在许多异种移植的临床前实验中均已观察到。特别是猪TFPI（组织因子途径抑制剂）不能有效抑制人因子Xa和VIIa / TF（组织因子）复合物以防止凝血酶形成。同样，猪血栓调节蛋白（THBD）无法与人凝血酶结合以激活抗血栓形成蛋白C以防止血凝块形成。除此之外，猪CD39在内皮细胞活化后会失活，其表达不足以抑制人血小板聚集。为了解决这些不兼容问题，已经测试了几种针对凝血途径的遗传修饰，并成功恢复了凝血相容性。

迄今为止，已尝试对猪进行单独或组合的40多种遗传修饰，以减轻与不相容性有关的超急性排斥，延迟异种移植排斥和急性细胞排斥。已经创建了具有三联敲除GGTA1，CMAH和B4GALNT2（以下称为“ 3KO”）的猪，与具有单联敲除GGTA1或双敲除GGTA1和CMAH的猪相比，它们的10个外周血单核细胞显示出最小的异种反应性抗体结合。此外，已经测试了多种人类转基因，其中一些在临床前模型中显示出有益的结果。

令人欣慰的是，最近的一项研究表明，从猪身上携带GGTA1基因敲除，hCD46和hTHBD过表达的心脏异种移植可以维持狒狒生命6个月。另一项研究表明，恒河猴存活了400多天，肾脏中携带有GGTA1敲除和hCD55过表达的肾脏异种移植物。而使用来自携带GGTA1基因敲除的猪的胰岛，将猪胰岛细胞异种移植到非人灵长类动物（NHP）糖尿病中显示出显著提高的植入率。这些研究支持使用基因工程异种移植器官可以实现长期移植存活。

尽管付出了多年努力，但目前尚未设计出具有消除PERV，提高免疫学和凝血相容性等综合功能的、临床应用中的理想猪器官。在杨璐函团队此次的研究中，研究人员试图使用不同的基因组修饰工具和克隆技术来创建可临床使用的猪器官。

具体而言，研究人员提高了猪生殖细胞编辑的规模，从使用CRISPR靶向单个重复基因座到使用多种基因组工程方法工程化18个不同基因座。研究人员使用CRISPR-Cas9和转座子在42个等位基因上对猪基因组进行了工程改造，并生产了带有PERV灭活，异种抗原KO和9种有效人类转基因的PERVKO.3KO.9TG猪。体外试验表明，这些猪对人的体液和细胞介导的损伤以及凝血功能异常具有明显的抵抗力，与同种异体移植相似。成功创建PERVKO.3KO.9TG猪表明向安全有效的猪异种移植迈出了重要一步，也代表着在生物体内工程新功能的合成生物学成就。

联想之星于2019年参与投资杭州启函生物，看好其拥有的全球最领先的基因编辑技术，以及为解决器官短缺问题所做的诸多有价值的尝试。

杨璐菡

除了启函生物，联想之星在基因编辑和基因治疗领域还投资了多家企业：

广州瑞风生物：利用CRISPR等前沿技术，进行地中海贫血等罕见病基因疗法的开发。瑞风生物由基因行业成功的连续创业者梁峻彬博士和全球首位人类胚胎基因编辑的明星科学家黄军就教授共同创立。

Carmine Therapeutics：利用红细胞（RBC）大规模生产胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EV），作为基因治疗最关键的基因递送载体。团队由世界著名的科学家和经验丰富的企业家组成。

Exegenesis Bio：创新基因疗法研发公司，聚焦基因治疗药物研发及产业化，将针对中国及全球市场，研发及生产基因治疗Best in class及First in class的创新药物。

联想之星自2010年即将医疗健康作为重点投资布局的领域之一，也是最早系统性布局医疗健康领域的早期投资机构。在医疗健康领域，联想之星将战略布局定为“新技术”与“新服务”两大板块。其中，新技术包括生物新药与疗法、基因技术与服务、诊断技术与高值耗材；新服务包括可“沉到基层”的诊断/数据终端、医疗服务的供给创新以及医疗资源的配置优化。在医疗健康领域，联想之星已投资近百个项目，包括派格生物、开拓药业、燃石医学、卡尤迪、康诺亚、高诚生物等。联想之星在2014年将生物制药的聚焦方向扩展到生物技术，从最开始的小分子药物，到大分子、单抗药物，延展到基因相关的医疗项目投资。

参考来源：

• https://www.sciencemag.org/news/2019/12/eyeing-organs-human-transplants-companies-unveil-most-extensively-gene-edited-pigs-yet

• https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2019.12.17.876862v1

• iNature：里程碑，颠覆器官移植，杨璐菡团队产生了神奇的基因编辑猪，即将可用于异种器官移植

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